蛋白質(zhì)是生命的中心。 在細胞過程，新陳代謝，催化生物化學反應和作為結(jié)構(gòu)元素等方面發(fā)揮著重要作用。 作為所有生命的重要元素，蛋白質(zhì)往往是生物醫(yī)學診斷研究和生命科學研究的主要研究內(nèi)容。
無論是進行蛋白質(zhì)提取，純化或標記，使用從細胞中提取的蛋白質(zhì)或用于研究生物分子之間相互作用的標記物，蛋白質(zhì)都是臨床，診斷和研究實驗室中的常見樣品。 蛋白質(zhì)濃度的測定是蛋白質(zhì)研究的關(guān)鍵部分。 在本應用中，使用Ocean HDX光譜儀生成牛血清白蛋白（BSA）的濃度標準曲線。 紫外波段的超高靈敏度，超低雜散光和高級光學元件，使得Ocean HDX成為UV吸收測量的理想選擇。
定量蛋白質(zhì)濃度的方法分為兩組 ：
1. 使用UV吸光度的直接檢測
2. 使用與蛋白質(zhì)反應以制備有色產(chǎn)物，并對其進行比色可見吸光度分析
在280nm處的直接吸光度測量，其中芳族氨基酸：色氨酸，酪氨酸和苯丙氨酸吸收 ，這種檢測相對較快，并且不用消耗蛋白質(zhì)。
使用試劑的比色測定可提供總蛋白質(zhì)濃度，但蛋白質(zhì)雜質(zhì)可能會影響測量結(jié)果。
不管用于蛋白質(zhì)定量的確切方法如何，第一步都是測量蛋白質(zhì)或標準蛋白質(zhì)的幾種稀釋度的吸光度。 在直接紫外吸收法的情況下，將280nm處的吸光度相對于每個樣品的已知濃度繪圖。 根據(jù)比爾定律（也稱為比爾朗伯定律），溶液的吸光度直接取決于吸收分子的濃度和光線通過樣品的光程。
這種關(guān)系使我們能夠使用為我們已知的蛋白質(zhì)樣品生成的標準曲線來確定未知蛋白質(zhì)樣品的濃度。
比爾定律規(guī)定：
A（λ）是溶液對波長的吸光度值
ε（λ）是作為該波長下的吸收分子的摩爾吸光系數(shù)或消光系數(shù)（L/ mol·cm）
c是溶液的濃度（mol / L）
l是光通過溶液所經(jīng)過的光程（cm）
未知蛋白質(zhì)濃度由通過數(shù)據(jù)點繪制的最佳擬合線進行確定。
標準曲線的線性部分是唯一用于確定未知樣品濃度的區(qū)域。測量值超出標準曲線線性范圍的樣品必須稀釋，直到吸光度落在線性范圍內(nèi)。基于測量濃度范圍之外的數(shù)據(jù)或超出圖的線性區(qū)域的濃度預測無效。
我們使用配置用于UV吸光度測量的 Ocean HDX光譜儀來生成牛血清白蛋白（BSA）的標準曲線。
Ocean HDX的高分辨率光學元件使其成為UV吸光度測量的理想選擇，并具有超低雜散光以獲得更高的最大吸光度水平，另外升級了的光學元件，可在緊湊的空間內(nèi)提供卓越的性能。
用水作為溶劑制備6mg / mL BSA（Sigma P/N A2153）儲備溶液并稀釋至0.02mg / mL，用于制定預測未知蛋白質(zhì)樣品濃度的標準曲線。值得我們的注意的是，BSA經(jīng)常用作生成校準曲線以預測蛋白質(zhì)濃度的標準蛋白質(zhì)。
使用OCEAN-HDX-UV-VIS光譜儀，DH-2000-BAL平衡氘鎢光源，CUV-UV比色皿支架，QP230-2-XSR極度抗紫外光纖兩根，并使用OceanView中的吸光度向?qū)нM行吸光度測量。
由于BSA不在可見光區(qū)域產(chǎn)生吸收，因此我們只需使用氘燈用于測量。 將光源限制在發(fā)生吸光度的區(qū)域會減少測量中的雜散光，從而為更高濃度的樣品提供更高的最大吸光度水平。 光譜儀和光源預熱60分鐘，通過消除光譜儀和光線升溫至一致溫度時發(fā)生的漂移，提高測量的穩(wěn)定性。
測量在石英比色皿中進行，測量之間未從比色皿支架上取下。 通過取出0.5mL樣品并用0.5mL水替換它，可實現(xiàn)直接在比色皿中進行稀釋。 在將水添加到比色皿之后，使用一次性移液管來混合樣品，進行稀釋至0.02mg / mL。
下圖1是使用Ocean HDX 測量的蛋白質(zhì)吸收光譜。
Ocean HDX 的超低雜散光性能使我們能夠測量280 nm處芳香族氨基酸峰的吸光度，幾乎達到3 AU。 注意，測量肽主鏈在220nm附近吸收的區(qū)域的吸光度值超過3AU（數(shù)據(jù)未顯示）。
圖1：在水中稀釋的BSA的吸光度。 根據(jù)比爾定律預測，吸光度在儀器的線性范圍內(nèi)隨濃度線性增加至?2.5 AU。
由BSA吸光度數(shù)據(jù)產(chǎn)生的標準曲線如圖2所示。在2.4和2.5 AU之間觀察到數(shù)據(jù)的平衡或滾降。 此滾降表示測量中存在雜散光。 雜散光（以不同程度存在于所有吸光度測量中）限制了系統(tǒng)可測量的最大吸光度值。
雜散光是來自設計光路外部的光線，無意中落在探測器的任何部位，從而產(chǎn)生錯誤的讀數(shù)。 檢測器不區(qū)分檢測器給定像素上的波長，它只是測量撞擊檢測器的光強度。 由于這個原因，如果光線在探測器上不應有的像素（波長）處著陸，探測器將錯誤地輸出該波長的讀數(shù)。 這種雜散光通常來自預期的光源，但在光譜儀內(nèi)散射并落在檢測器的錯誤部分，但它也可能完全來自不同的源。 該燈設置系統(tǒng)可實現(xiàn)的最大吸光率的工作限制，并通過限制系統(tǒng)的黑暗程度來降低信噪比。 雜散光的常見來源包括光柵中的高階反射，光柵中的缺陷，光譜儀內(nèi)部的反射以及光譜儀外殼中的光泄漏。
Ocean HDX擁有在改尺寸下最小的雜散光和可測量的最大吸光度水平。
圖2：BSA標準曲線包括0至6mg / mL濃度的超過30個數(shù)據(jù)點。 請注意在2.4到2.5AU之間的光譜的滾降或流平，其中雜散光限制最大吸光度。
圖3，來自最高蛋白濃度的數(shù)據(jù)點已經(jīng)從圖中去除以評估測量的線性范圍。 如R2值的改善，表明該線的方程式更適合并且將提供更準確的蛋白質(zhì)濃度值，但是在2.5 AU下仍然有一些滾降。其他在4到4.5AU之間的吸光度，需要額外測量來評估該區(qū)域的線性。
圖3：吸光度測量的近似線性范圍的BSA標準曲線。
使用該圖，使用最佳擬合線的方程計算未知BSA或其他蛋白質(zhì)樣品的濃度，其中y是未知樣品的吸光度值。
標準曲線（也稱為校準曲線）是許多生物醫(yī)學，診斷和生命科學研究實驗室中的典型應用。 準確測定蛋白質(zhì)濃度是涉及蛋白質(zhì)分析的第一步。 憑借超低雜散光，升級的光學元件和高紫外靈敏度，Ocean HDX非常適合測量紫外吸光度，包括確定未知蛋白質(zhì)濃度所需的測量。